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顯微鏡

熒光顯微鏡的工作原理

發(fā)布日期:2022-10-09 點(diǎn)擊率:49

        

 

  光源

 

  多采用200W的超高壓汞燈作光源,它是用石英玻璃制作,中間呈球形,內(nèi)充一定數(shù)量的汞,工作時由兩個電極間放電,引起水銀蒸發(fā),球內(nèi)氣壓迅速升高,當(dāng)水銀完全蒸發(fā)時,可達(dá)50~70個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力,這一過程一般約需5~15min。超高壓汞燈的發(fā)光是電極間放電使水銀分子不斷解離和還原過程中發(fā)射光量子的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光,足以激發(fā)各類熒光物質(zhì),因此,為熒光顯微鏡普遍采用。

 

  超高壓汞燈也散發(fā)大量熱能。因此,燈室必須有良好的散熱條件,工作環(huán)境溫度不宜太高。

 

  新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃,使用一些時間后,則需要高壓啟動(約為15000V),啟動后,維持工作電壓一般為50~60V,工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命,在每次使用2h的情況下約為200h,開動一次工作時間愈短,則壽命愈短,如開一次只工作20min,則壽命降低50%。因此,使用時盡量減少啟動次數(shù)。燈泡在使用過程中,其光效是逐漸降低的。燈熄滅后要等待冷卻才能重新啟動。點(diǎn)燃燈泡后不可立即關(guān)閉,以免水銀蒸發(fā)不完全而損壞電極,一般需要等15min。由于超高壓汞燈壓力很高,紫外線強(qiáng)烈,因此燈泡必須置燈室中方可點(diǎn)燃,以免傷害眼睛和發(fā)生爆炸時造成操作。

 

  超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮(zhèn)流、啟動幾個部分。在燈室上有調(diào)節(jié)燈泡發(fā)光中心的系統(tǒng),燈泡球部后面安裝有鍍鋁的凹面反射鏡,前面安裝有集光透鏡。

 

  國產(chǎn)超高壓汞燈GCQ-200型性能良好,可以代替HBO-200等型的進(jìn)口燈泡,平均壽命在200h以上,價格也比較低。

 

  我國研制的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置,體積小,重量輕,功率小,交、直流兩用(自帶直流電源),易于攜帶,使用方便,已推廣應(yīng)用。

 

  濾色系統(tǒng)

 

  濾色系統(tǒng)是熒光顯微鏡的重要部位,由激發(fā)濾板和壓制濾板組成。濾板型號,各廠家名稱常不統(tǒng)一。濾板一般都以基本色調(diào)命名,前面字母代表色調(diào),后面字母代表玻璃,數(shù)字代表型號特點(diǎn)。如德國產(chǎn)品(Schott)BG12,就是種藍(lán)色玻璃,B是藍(lán)色的第一個字母,G是玻璃的第一個字母;我國產(chǎn)品的名稱已統(tǒng)一用拼音字母表示,如相當(dāng)于BG12的藍(lán)色濾板名為QB24,Q是青色(藍(lán)色)拼音的第一個字母,B是玻璃拼音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名,如K530,就是表示壓制濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數(shù)字命名,如美國Corning廠的NO:5-58,即相當(dāng)于BG12。

 

  1.激發(fā)濾板根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn),可選用以下三類激發(fā)濾板,提供一定波長范圍的激發(fā)光。

 

  紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過,阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5,外加一塊BG-38,以除去紅色尾波。

 

  紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3,外加BG-38。

 

  紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。

 

  最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。

 

  開始采用金屬膜干涉濾板,由于針對性強(qiáng),波長適當(dāng),因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達(dá)明的S546綠色濾板,均遠(yuǎn)比玻璃濾板效果好。

 

  激發(fā)濾板分薄厚兩種,一般暗視野選用薄濾板,亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些?;疽笫且垣@得最明亮的熒光和最好的背景為準(zhǔn)。

 

  2.壓制濾板壓制濾板的作用是完全阻擋激發(fā)光通過,提供相應(yīng)波長范圍的熒光。與激發(fā)濾板相對應(yīng),常用以下3種壓制濾板:

 

  紫外光壓制濾板:可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

 

  紫藍(lán)光壓制濾板:能通過510nm以上波長的光(綠到紅),能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

 

  紫外紫光壓制濾板:能通過460nm以上波長的光(藍(lán)到紅),可與BG-3組合,常用OG-11K470AK 490,K510。

 

  反光鏡

 

  反光鏡的反光層一般是鍍鋁的,因為鋁對紫外光和可見光的藍(lán)紫區(qū)吸收少,反射達(dá)90%以上,而銀的反射只有70%;一般使用平面反光鏡。

 

  聚光鏡

 

  專為熒光顯微鏡設(shè)計制作的聚光器是用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。分明視野聚光器和暗視野聚光器兩種。還有相差熒光聚光器。

 

  1.明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器,它具有聚光力強(qiáng),使用方便,特別適于低、中倍放大的標(biāo)本觀察。

 

  2.暗視野聚光器暗視野聚光器在熒光顯微鏡中的應(yīng)用日益廣泛。因為激發(fā)光不直接進(jìn)入物鏡,因而除散射光外,激發(fā)光也不進(jìn)入目鏡,可以使用薄的激發(fā)濾板,增強(qiáng)激發(fā)光的強(qiáng)度,壓制濾板也可以很薄,因紫外光激發(fā)時,可用無色濾板(不透過紫外)而仍然產(chǎn)生黑暗的背景。從而增強(qiáng)了熒光圖像的亮度和反襯度,提高了圖像的質(zhì)量,觀察舒適,可能發(fā)現(xiàn)亮視野難以分辨的細(xì)微熒光顆粒。

 

  3.相差熒光聚光器相差聚光器與相差物鏡配合使用,可同時進(jìn)行相差和熒光聯(lián)合觀察,既能看到熒光圖像,又能看到相差圖像,有助于熒光的定位準(zhǔn)確。一般熒光觀察很少需要這種聚光器。

 

  物鏡

 

  各種物鏡均可應(yīng)用,但最好用消色差的物鏡,因其自體熒光極微且透光性能(波長范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比,而與其放大倍數(shù)成反比,所以為了提高熒光圖像的亮度,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其在高倍放大時其影響非常明顯。因此對熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本,應(yīng)使用鏡口率大的物鏡,配合以盡可能低的目鏡(4×,5×,6.3×等)。

 

  目鏡

 

  在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡,如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡,因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上,但研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡,觀察很方便。

 

  落射光裝置

 

  新型的落射光裝置是從光源來的光射到干涉分光濾鏡后,波長短的部分(紫外和紫藍(lán))由于濾鏡上鍍膜的性質(zhì)而反射,當(dāng)濾鏡對向光源呈45。傾斜時,則垂直射向物鏡,經(jīng)物鏡射向標(biāo)本,使標(biāo)本受到激發(fā),這時物鏡直接起聚光器的作用。同時,濾長長的部分(綠、黃、紅等),對濾鏡是可透的,因此,不向物鏡方向反射,濾鏡起了激發(fā)濾板作用,由于標(biāo)本的熒光處在可見光長波區(qū),可透過濾鏡而到達(dá)目鏡觀察,熒光圖像的亮度隨著放大倍數(shù)增大而提高,在高放大時比透射光源強(qiáng)。它除具有透射式光源的功能外,更適用于不透明及半透明標(biāo)本,如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)標(biāo)本等的直接觀察。研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置,稱之為落射熒光顯微鏡。

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