1 引言
近幾年，基于電化學原理的安培酶免疫檢測發(fā)展迅速，在食品工業(yè)、環(huán)境監(jiān)測與處理、生物技術及臨床診斷等領域都有著廣泛的應用。
利用抗原抗體之間的特異性親和作用以及酶的催化放大作用，通過檢測與待測物濃度相關的電流信號實現(xiàn)生物分子的檢測和識別，相對于傳統(tǒng)的光譜免疫檢測具有響應快、靈敏度高、成本低、體積小等特點。
基于MEMS工藝在硅襯底上制備微電極結構實現(xiàn)免疫檢測，能夠實現(xiàn)免疫傳感器器件的微型化、檢測試劑的微量化以及生產的批量化但這類免疫傳感器仍處于實驗室研究階段，很多性能還有待改善，例如傳感器的穩(wěn)定性和一致性較差，這在很大程度上阻礙了其向實用化、市場化方向的發(fā)展。
影響微型免疫傳感器穩(wěn)定性和一致性的因素較多，包括生物敏感膜的質量以及免疫檢測過程中的可控性等首先生物敏感膜是生物傳感器的識別元件，是生物傳感器的核心對于日益微型化的免疫傳感器，既需要在微尺度下行免疫分子的固相化，又要保證固相免疫分子的數(shù)量和活性，同時又要保證不同免疫傳感器生物敏感膜固化的一致性，具有很大的難度常規(guī)對微傳感器敏感表面進行修飾的方法，無論在同化機理上是采用共價結合還是物理吸附，多采用浸泡、滴涂等方法來實現(xiàn)每次對樣品的處理時間以及試劑添加量的多少，往往因人而異，同時也受環(huán)境條件的影響，使制備的生物敏感膜的穩(wěn)定性和一致性難以保證因此需要進行生物敏感膜固化過程的可控性技術和方法研究，以提高傳感器的一致性和穩(wěn)定性。
其次，根據(jù)電流型免疫傳感器檢測的原理和特點，在免疫檢測的過程中需要依次在傳感器表面加入待測抗原、酶標抗體以及反應底物，并要在這些過程中對電極表面進行反復清洗如此繁瑣的試劑添加過程目前在實驗室階段多采用人工滴加的方法來完成，帶來的不穩(wěn)定因素眾多，很難保證傳感器工作環(huán)境的穩(wěn)定和標準，從而影響傳感器檢測結果的穩(wěn)定性和可靠性。
基于以上考慮，本文在MEMS工藝制備的電極型免疫微傳感芯片的基礎上，設計和制備微反應室以及微進出樣溝道，利用SU-8膠和PDMS等材料搭建微流體系統(tǒng)，用以結合蠕動泵完成敏感膜固定化及進樣和清洗等免疫檢測操作過程，消除人為干擾，改善生物敏感膜制備以及免疫反應環(huán)境，探索提高生物敏感膜固化的穩(wěn)定性和一致性，為提高免疫微傳感器檢測一致性的研究積累方法和經驗。
2 系統(tǒng)設計和制作
根據(jù)免疫傳感器檢測的原理及特點，并針對提高微型免疫生物傳感器穩(wěn)定性和一致性的需要，進行微流體系統(tǒng)的設汁和研究設計面向應用化和穩(wěn)定的免疫檢測系統(tǒng)，考慮到低成本和易操作等因素，采用將微反應室和反應電極分別制作的方法實驗時在電極片表面粘附微結構形成微反應系統(tǒng)進行免疫檢測，反應結束后可以將反應室與電極分開，相對于一次性的反應電極，微反應窒可以經處理后實現(xiàn)重復使用。
2.1 微流體系統(tǒng)的結構設計
基于MEMS工藝制備的電極型免疫微傳感器結構如圖1所示，包括圓形的工作電極和環(huán)形的對電極，工作電極敏感面積為1 mm2，該免疫傳感器具有微型化、試劑用量少的特點根據(jù)免疫傳感器的工作原理，設計包括微型反應室和進出樣溝道的微流體系統(tǒng)，配合蠕動泵實現(xiàn)自動加樣系統(tǒng)以實現(xiàn)免疫檢測過程微流體結構如圖2所示，微反應室搭建在由工作電極和對電極所組成的敏感反應區(qū)域上通過計算檢測時電極表面所需樣品的體積，設計高為500 μm、直徑為5 mm的圓柱形微反應室，將微型免疫電極置于其中心。
在微小空間內進行液體樣品的進出樣品操作，肯定會對微反應室壁和電極表面產生一定壓力為了保證整個反應室的密封性和電極表面敏感區(qū)域免受流體沖擊而保持敏感膜的完好無損，同時為了保證敏感電極表面免疫反應和電化學反應發(fā)生的均一性，綜合進出樣流速及保證電極表面樣品均勻分布等因素，合適設計微室結構以及進液口和出液口的數(shù)量和尺寸，使得在沒有微閥的情況下，實驗試劑在進入微室后能夠良好地分布于反應電極表面區(qū)域，并能被順利排出不會殘留在微室內。
根據(jù)以上考慮，實驗中設計了4種不同結構，如圖3所示，中心圓柱體是微反應室腔，頂部的小圓柱體為進液溝道，底部的方形結構為設計的出液溝道，進液口位置有中心和邊緣位置兩種，出液溝道數(shù)量有4種。
2.2 微流體結構制備材料的研究
2.2.1 微流體結構材料的選擇
PDMS具有無毒、用澆鑄法能復制微通道、加工簡便快速和成本低等特點，所以選擇將PDMS覆于模具上，固化成膜后揭下來壓于電極片表面上密封構成微反應室，這樣PDMS具有良好的化學惰性，可以避免微溝道對反應試劑的污染而且PDMS固化后的彈性可以緩沖微流帶來的對微反應室的力的作用，允許外力均勻地施加在電極表面的周圍。
2.2.2 微流體結構模具材料的選擇
在MEMS工藝中，500 μm的反應室高度較厚，如用深刻蝕等工藝在硅片上實現(xiàn)如此深的結構較為困難SU-8膠是MEMS工藝中的一種厚膠材料，常用于深結構的制備，故實驗采用SU-8膠制作微流體結構模具而如此厚的SU-8膠所帶來的應力和表面張力在制作過程中嚴重影響到硅片的形狀，故采用玻璃圓片為材料，這樣也降低了成本。
3 仿真結果
對于電流型免疫傳感器，其免疫反應和電化學反應主要發(fā)生于中心圓形工作電極區(qū)域在微小的反應空間內，如果修飾溶液、待檢測樣品、清洗液等試劑能夠以工作電極圓心為中心，在圓形電極表面均勻和對稱的流動和分布來參與反應，在敏感膜固化的過程中將能夠提高生物敏感膜固化過程的一致性，從而保證生物敏感膜的質量在免疫反應過程中將能夠促進敏感膜表面抗原抗體之間免疫反應的均一性，同時促進敏感表面電化學反應發(fā)生的一致性，從而提高傳感器的響應速度并增大信號響應在清洗的過程中能夠增加電極敏感表面清洗的潔凈性和一致性，減少非特異性信號干擾給傳感器檢測所帶來的偏差，增加檢測的穩(wěn)定性和一致性同時可以避免因反應液局部密集所帶來的電流生成不均，避免敏感膜表面受力不均產生的局部脫落等問題。
根據(jù)設計的4種微流體結構，實驗采用fluent軟件進行微流體模擬，驗證不同結構的可行性，通過性能上的一些比對，選擇合適的微反應室和進出樣溝道結構。
3.1 流速與密度分布仿真
如圖4所示，對試劑在進出樣、清洗等操作過程中的流動情況進行仿真試劑進入微反應室后，在電極表面附近，液體的流速以電極表面對稱試劑在電極表面分布較為均勻，沒有液體局部集中、分布不對稱的情況出現(xiàn)4種結構下反應試劑能夠均等地流入到敏感反應區(qū)域參加反應，到達電極表面后都能均勻分布于敏感區(qū)域及其周圍，較好地參與反應，同時采用PBS緩沖液也能夠較好地完成清洗任務。
3.2 壓力分布仿真
檢測過程中應考慮液體輸入微反應室時對工作電極表面敏感膜及室壁產生的力的作用，因為力的作用不當會產生敏感膜脫落的現(xiàn)象實驗過程中通過合適地設計選擇進液口位置來優(yōu)化力的分布，減少對敏感膜表面產生的沖擊在設計的4種結構中，對進液口位置的選擇分成中心處和邊緣處兩種，兩種結構的壓力分布圖對例如圖5所示在進液管道附近，液體產生較大的力的作用，而將進液口從反應區(qū)域正上方移至邊緣處，其產生的力會在中心敏感區(qū)域外圍被電極周邊區(qū)域和富有彈性的PDMS室壁緩沖而減弱，不會影響到敏感膜生成區(qū)域，較好地解決了進出液對敏感膜可能造成的損害問題；而在中心開口的兩種結構位于敏感反應區(qū)上方，如圖可見試劑輸人時會有力作用于中心處，特別是當液體輸入速度較高時，會對敏感膜造成損傷。
綜合以上模擬分析，從微流體在微反應室內的密度、速度及壓力的分布模擬展開討論和比較，論證了設計結構的可行性，并得到了在邊緣處設置進液口的結構較在中心處設置進液口的結構更為合適的結論當然反應操作過程中實際效果還與進樣流速和所用試劑黏稠度的選擇等因素有關，因此通過計算設計，制作了不同的微室結構(包括進出液溝道位置、數(shù)量及尺寸的不同選擇)，如圖6下一步將結合實際檢測進一步優(yōu)化結構和參數(shù)。
4 結束語
本文在MEMS工藝制備的電流型免疫傳感器基礎上，利用SU-8膠和PDMS等材料搭建微流體系統(tǒng)，設計和制備了微反應室以及微進出樣溝道，進行了生物敏感膜固化過程的可控性技術及方法研究方面的探索，是提高免疫微傳感器檢測一致性及穩(wěn)定性方法研究的關鍵內容之一，對日益微型化的免疫生物傳感器的研制有著重要的研究意義和實用價值通過fluent軟件的模擬，對不同結構下微流體所產生的密度、速度和壓力分布給敏感膜固化和免疫檢測所帶來的影響進行了分析和比較，并做出了結構上的優(yōu)化和選擇為下一步配合蠕動泵進行免疫檢測實驗，尋求消除人為干擾、改善微免疫檢測環(huán)境以及對微反應系統(tǒng)進一步的改進打下基礎，也為提高電流型免疫微傳感器的穩(wěn)定性和一致性研究積累了方法和經驗。
