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    細菌工程菌胞內(nèi)表達主要分為兩種形式，一種是在強啟動子條件下的高效表達，由于蛋白的過度表達;

    使蛋白不能及時有效折疊而發(fā)生無規(guī)則卷曲，以固體顆粒的形式堆積于胞間質(zhì)中，這就是所說的包涵體;

    另外一種是間質(zhì)內(nèi)的可溶性表達，即可以發(fā)生正常折疊，具有生物活性。

    一般情況下，細菌只要被正常破壁就可以通過離心的形式將包涵體和可溶性表達的蛋白分離開。

    超聲破碎的條件一般是300w，10s/10s，20分鐘，具體條件可根據(jù)自身情況而定。

    超聲前菌體的準備：菌液離心后，先用PBS將菌沉淀洗2-3遍;

    然后按原菌液體積的1/5-1/10加入裂解液重懸菌體，裂解液的成分：

    50mMTris-HCl,pH8.0,2mMEDTA，100mMNaCl，加溶菌酶至100ug/ml，0.1%TritonX-100。切記冰浴超聲！

    如何判斷是否超聲完全，根據(jù)經(jīng)驗，一般有以下幾個方面：

    1，外觀判斷：超聲前菌懸液是渾濁的，超聲完全后變的透明、清澈。

    2，液體的粘性：超聲后菌液從槍頭滴下不粘連。

    3，高速離心：有用高速離心檢測超聲破碎程度的（一般用6,000g10min,比一般離心收集菌體的轉(zhuǎn)速高一點）。沉淀是未破碎或破碎不完全的菌體。

    4，染色：破碎后的菌液涂片，革蘭氏結晶紫溶液染色0.5分鐘，鏡檢。

    （超聲后加入核酸酶消除核酸對蛋白的污染）

    一些需要注意的問題：

    1，蛋白以包涵體形式表達，追求的是高破碎率，要求細胞碎片很小;

    而另一種蛋白是可溶形式表達，所以細胞碎片不能很小，兩種情況要求不同但目的相同，都是便于后期的固液分離。

    2，如果超聲時出現(xiàn)黑色沉淀，說明超聲功率太強。

    3，超聲時間太長、功率太高對蛋白活性肯定有影響。

    4，盡量防止泡沫的產(chǎn)生。

標簽:                                    超聲波細胞破碎儀