蛋白標(biāo)簽（protein tag）是指與目的蛋白一起融合表達(dá)的一段多肽（包括小肽）或者蛋白，其作用是便于目的蛋白的表達(dá)、純化、檢測(cè)和示蹤等。過去數(shù)十年，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)和開發(fā)出了具有各種不同功能的蛋白標(biāo)簽，已在基礎(chǔ)研究和產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品生產(chǎn)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。
實(shí)際上，任何一個(gè)蛋白或多肽只要其具有促進(jìn)表達(dá)、便于純化或檢測(cè)等功能，都可以成為另一個(gè)蛋白或多肽的標(biāo)簽（或標(biāo)簽蛋白）。所以文獻(xiàn)報(bào)道可以當(dāng)做標(biāo)簽使用的蛋白或多肽超過數(shù)百種之多。但是，根據(jù)使用的廣泛程度和通用性衡量，常用的蛋白標(biāo)簽并不多。如上文所述，標(biāo)簽蛋白有多種多樣的用途，本文將僅就有利于表達(dá)和純化的標(biāo)簽進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，希望對(duì)大家在表達(dá)和制備外源蛋白時(shí)有所幫助。
（一）便于純化的標(biāo)簽
這類標(biāo)簽一般對(duì)外源蛋白的表達(dá)沒有明顯影響，主要是便于純化和蛋白的檢測(cè)。這類標(biāo)簽首推多聚組氨酸標(biāo)簽， 通常是6個(gè)組氨酸殘基構(gòu)成的小肽，此外，還有Strep tag標(biāo)簽及其改進(jìn)型StrepII tag也應(yīng)用較為廣泛。
1.His6 tag
常用的是6個(gè)連續(xù)的組氨酸殘基（His6）構(gòu)成的小肽，一般6-10殘基都可以使用，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。組氨酸殘基側(cè)鏈與固態(tài)的鎳有強(qiáng)烈的吸引力，可用于固定化金屬螯合層析(IMAC)，對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化。使用His-tag有下面優(yōu)點(diǎn)：
1）標(biāo)簽的分子量小，只有~0.84KD，一般不影響目標(biāo)蛋白的功能;
2）His標(biāo)簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化，前者在純化疏水性強(qiáng)的蛋白得到應(yīng)用，后者在純化包涵體蛋白時(shí)特別有用，用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白，使復(fù)性不受其它蛋白的干擾，或進(jìn)行金屬螯和親和層析復(fù)性;
3）His標(biāo)簽免疫原性相對(duì)較低，可將純化的蛋白直接注射動(dòng)物進(jìn)行免疫并制備抗體。
4）可應(yīng)用于多種表達(dá)系統(tǒng)，純化的條件溫和;
5）可以和其它的親和標(biāo)簽一起構(gòu)建雙親和標(biāo)簽。
2.Strep tag和StrepII tag
前者長(zhǎng)38個(gè)氨基酸殘基，后者是其突變改進(jìn)形式，長(zhǎng)8個(gè)氨基酸殘基。前者用鏈親和素（Streptavidin）偶聯(lián)的層析柱純化，后者用改進(jìn)型的鏈親和素（Strep-Tactin）偶聯(lián)的親和層析柱純化。它們的結(jié)合力和結(jié)合特異性都非常不錯(cuò)，應(yīng)用較為廣泛。
（二）促進(jìn)表達(dá)的標(biāo)簽
這類標(biāo)簽主要具有促進(jìn)與之融合的目的蛋白表達(dá)的作用，基本上都具有分子伴侶或折疊酶的功能。
1.二硫鍵形成相關(guān)蛋白類（Dsb）蛋白標(biāo)簽
主要有DsbA、DsbC和DsbG蛋白，后兩者更為常用。這是一類在大腸桿菌蛋白折疊過程中發(fā)揮輔助功能的蛋白質(zhì)，能促進(jìn)二硫鍵的正確形成，都具有很強(qiáng)的分子伴侶功能，可以促進(jìn)外源蛋白的表達(dá)，且能促進(jìn)外源蛋白可溶表達(dá)。
2.FkpA類蛋白標(biāo)簽
FkpA為大腸桿菌肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶，在蛋白翻譯折疊過程中發(fā)揮重要作用，也具有很強(qiáng)的分子伴侶效應(yīng)。可促進(jìn)外源蛋白以可溶形式高效表達(dá)。
3.SUMO標(biāo)簽
SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素樣修飾蛋白（Small ubiquitin-like modifier），是泛素（ubiquitin）類多肽鏈超家族的重要成員之一。SUMO可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽和分子伴侶，不但可以提高融合蛋白的表達(dá)量，且具有抗蛋白酶水解以及促進(jìn)靶蛋白正確折疊，提高重組蛋白可溶性等功能。
SUMO標(biāo)簽還有一項(xiàng)重要的特點(diǎn)，就是可用于完整地切除標(biāo)簽蛋白，得到天然蛋白。因?yàn)镾UMO蛋白水解酶能識(shí)別完整的SUMO標(biāo)簽蛋白序列，并能高效地把SUMO從融合蛋白上切割下來。切除SUMO后，經(jīng)過親和層析，去除標(biāo)簽蛋白部分，就得到和天然蛋白一樣的重組蛋白。所以SUMO標(biāo)簽也常用于和其他標(biāo)簽一起應(yīng)用，作為特異酶切水解位點(diǎn)。
4.NusA（N-utilization substance A）蛋白
NusA蛋白是文獻(xiàn)報(bào)道在大腸桿菌中促進(jìn)外源蛋白表達(dá)能力強(qiáng)的標(biāo)簽蛋白之一。
這類標(biāo)簽蛋白還有很多種，它們促進(jìn)表達(dá)的效果也有一些差異，而且針對(duì)不同蛋白，不同的標(biāo)簽蛋白的促表達(dá)作用也不盡相同，需要通過表達(dá)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。
（三）同時(shí)具有促進(jìn)表達(dá)和便于純化的標(biāo)簽
這類標(biāo)簽也包含多種，一般都能不同程度促進(jìn)蛋白的表達(dá)，而且也有相對(duì)應(yīng)的純化方法，可以進(jìn)行一步純化。
1. MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽
MBP標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
純化：融合蛋白可通過交聯(lián)淀粉（Amylose）的親和層析一步純化。結(jié)合的融合蛋白可用10mM麥芽糖在生理緩沖液中進(jìn)行洗脫。一些融合蛋白在0.2% Triton X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效結(jié)合，而其他融合蛋白則不受影響。 緩沖條件為pH7.0到8.5，鹽濃度可高達(dá)1M，但不能使用變性劑。
2.GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽
GST（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽蛋白本身是一個(gè)在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶，它的天然大小為26kD。GST有兩個(gè)特點(diǎn)，一個(gè)是它可以在大腸桿菌中大量表達(dá)，起到提高表達(dá)量的作用；另一個(gè)是它是一個(gè)高度可溶的蛋白，利用它增加外源蛋白表達(dá)的可溶性。GST融合表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于各種融合蛋白的表達(dá)，可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細(xì)胞中表達(dá)。結(jié)合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在多數(shù)情況下，融合蛋白在水溶液中是可溶的。
純化：該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和介質(zhì)進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會(huì)失去對(duì)谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。
3. Calmodulin-binding peptide（鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，CBP）標(biāo)簽
CBP由26個(gè)氨基酸殘基組成，有一定的促表達(dá)效果，但主要是可以用來做親和純化。將鈣調(diào)蛋白偶聯(lián)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上，能非常特異的純化CBP融合蛋白，洗脫條件為溫和的鈣離子緩沖液。
4. Chitin-binding domain（幾丁質(zhì)結(jié)合域，CBD）
CBD由51個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，有一定的促表達(dá)效果，但主要也是用來做融合蛋白的親和純化。將幾丁質(zhì)偶聯(lián)在層析介質(zhì)上就得到了CBD親和層析介質(zhì)。可以一步純化CBD融合蛋白，然后用幾丁質(zhì)或其類似物溶液競(jìng)爭(zhēng)洗脫就能將融合蛋白洗脫下來，洗脫條件也很溫和。
（四）便于檢測(cè)的標(biāo)簽
這一類標(biāo)簽的主要作用是提供一類檢測(cè)與之相融合的目的蛋白的便捷方法，如果有針對(duì)這些標(biāo)簽的特異抗體，這些標(biāo)簽也可應(yīng)用于目的蛋白的親和純化。
1.Flag標(biāo)簽蛋白
Flag標(biāo)簽為編碼8個(gè)氨基酸的親水性多肽（DYKDDDDK），其融合表達(dá)目的蛋白后具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1）作為融合表達(dá)標(biāo)簽，F(xiàn)lag通常不會(huì)與目的蛋白相互作用并且通常不會(huì)影響目的蛋白的功能、性質(zhì)，這樣就有利用研究人員對(duì)融合蛋白進(jìn)行下游研究。
2）融合在N端的Flag，可以被腸激酶切除（DDDK），從而得到特異的目的蛋白。因此Flag標(biāo)簽現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關(guān)領(lǐng)域。
3）易于用Anti-Flag的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
2.HA標(biāo)簽
HA標(biāo)簽蛋白，序列為YPYDVPDYA的9個(gè)氨基酸殘基多肽，源于流感病毒的紅細(xì)胞凝集素表面抗原決定簇，對(duì)外源靶蛋白的空間結(jié)構(gòu)影響小, 容易構(gòu)建成標(biāo)簽蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti-HA的抗體進(jìn)行檢測(cè)。
3.c-Myc標(biāo)簽
C-Myc 標(biāo)簽蛋白，是一個(gè)含10個(gè)氨基酸殘基的小標(biāo)簽，標(biāo)簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，這10個(gè)氨基酸殘基作為抗原表位表達(dá)在不同的蛋白質(zhì)中仍可識(shí)別其相應(yīng)抗體。C-Myc tag已成功應(yīng)用在 Western-blot雜交技術(shù)、免疫沉淀和流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)中，可用于檢測(cè)重組蛋白質(zhì)在靶細(xì)胞中的表達(dá)。
4.Avi Tag
Avi Tag標(biāo)簽蛋白是一個(gè)15個(gè)氨基酸殘基組成的短肽，具有一個(gè)單生物素化賴氨酸位點(diǎn)，與已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目標(biāo)蛋白的N端和C端。融合表達(dá)后，可被生物素連接酶生物素化。為了純化重組蛋白，選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白質(zhì)分離純化，還用于蛋白質(zhì)相互作用研究。
Avi Tag標(biāo)簽系統(tǒng)具有以下幾大優(yōu)點(diǎn)：
1）無論在體外或者體內(nèi)，幾乎所有的蛋白都可以在一個(gè)獨(dú)特的Avi Tag位點(diǎn)輕易且有效地被生物素化；
2）生物素化是通過酶和底物的反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，反應(yīng)條件相當(dāng)溫和而且標(biāo)記的專一性極高；
3）生物素Avi Tag只有15個(gè)氨基酸，對(duì)蛋白空間結(jié)構(gòu)的影響非常小；
4）生物素與鏈親和素具有很高的很專一的結(jié)合活性，非常便于后期檢測(cè)。
（五）標(biāo)簽的切除
一般為了不影響目的蛋白的后續(xù)應(yīng)用，都會(huì)選擇一定的方式將表達(dá)時(shí)帶上的各種標(biāo)簽去除。所以在設(shè)計(jì)構(gòu)建載體時(shí)可以在標(biāo)簽蛋白和外源蛋白之間加上蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，這樣表達(dá)純化得到融合有標(biāo)簽的目的蛋白后通過蛋白酶切的方式將標(biāo)簽去除，得到完整的目的蛋白。這些常用的蛋白酶位點(diǎn)有：HRV 3C蛋白酶切位點(diǎn)、TEV蛋白酶切位點(diǎn)、腸激酶切位點(diǎn)、SUMO蛋白酶切位點(diǎn)等。但是也有幾點(diǎn)需要說明：
1.這些酶切位點(diǎn)特異性都比較高，但切割效率各不相同；
2.除了SUMO蛋白酶之外，其它常用蛋白酶切除標(biāo)簽后都會(huì)殘留幾個(gè)氨基酸殘基。SUMO蛋白酶識(shí)別的是SUMO標(biāo)簽的空間結(jié)構(gòu)，然后將這個(gè)標(biāo)簽完整切除，不會(huì)留下多余的氨基酸殘基；
3.蛋白酶的切割效率也受識(shí)別位點(diǎn)附近的氨基酸殘基性質(zhì)的影響，具體可以參見有關(guān)文獻(xiàn)；
4.有些標(biāo)簽比較小，免疫原性也很弱，一般不用切除，也不會(huì)對(duì)后續(xù)研究和應(yīng)用產(chǎn)生影響，可以不必切除。但是有些大的標(biāo)簽，如Dsb蛋白、FkpA蛋白、GST蛋白、SUMO標(biāo)簽等等，還是需要切除的。
